拖尾因子-药物非临床研究试验过程中供试品配制与分析注意事项

药物非临床研究是在实验室条件下，使用不同的实验系统进行各种毒性试验来评价药物安全性的一种研究[1]。动物是非临床研究中使用最频繁的一种实验系统，但因动物本身的特性，其自主用药的依从性差，因此试验过程中需在试验人员的参与下，保证动物按时摄入规定的药量以确保试验结果的准确性。

CFDA、FDA、EMA、ICH等指导原则均要求动物试验的给药方式与临床用药方式需尽量保持一致，以便试验结果可以外推至临床研究[2]。临床上药物常见的给药方式包括：胃肠道给药（口服、舌下、直肠给药）、注射给药（静脉、肌肉、皮下注射）、呼吸道给药和经皮给药4种[3]，相应的非临床研究可以根据该给药方式在体内的代谢情况并兼顾动物福利要求选择合适的给药方式。目前，非临床研究多采用经口灌胃、注射、吸入和经皮的方式给药。除吸入外，其它几种给药方式均有可能涉及供试品配制。因此专题负责人确定给药方式后需首要解决的问题便是寻找一种合适的溶媒将药物配制成一种方便给药的状态。

一、溶媒选择

用于供试品配制的溶媒需保证：

（1）毒性小、无刺激性；

（2）不与供试品发生反应，且供试品在该溶媒中稳定；

（3）对药物有较好的分散性和溶解性

（4）对供试品的动力学和药效学无明显影响[4]。

根据供试品在水中的溶解度，将供试品分为易溶于水、微溶于水、难溶于水和不溶于水4种，易溶于水的供试品可选择的溶媒范围较广，试验中注意供试品在溶媒中的稳定性和溶媒对机体的影响即可，其它类型的供试品配制时可能需加入助悬剂、增溶剂、乳化剂或助溶剂使药物溶解或形成较均匀的混悬液。不同的给药方式对供试品溶解程度的要求也不同，需经口灌胃给药的供试品对溶解程度要求较低，只要其可以保持均一、可以顺利通过灌胃针，无大量气泡即可满足给药要求；需注射给药的供试品，特别是静脉注射给药的药品需为溶液或乳剂，设计配制方法时需注意该溶媒不得导致红血球溶解或使蛋白沉淀；肌肉、皮下给药的供试品可以为油溶液、混悬液或乳剂；腹腔注射的供试品可以是溶液或混悬液。

试验过程中如遇到溶解性问题，可参考《中国药典 第四部 药用辅料》（2020年）[5]寻找合适的溶剂或助溶剂。例如注射剂中常用的助溶剂：乙醇、丙二醇、甘油等有机溶剂，乳化剂：十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、三油酸山梨坦等；口服制剂中常用的助悬剂：甘油、山梨醇、羧甲级纤维素钠以及环糊精类物质；以及为保持药物稳定性或维持渗透压使用的pH调节剂：碳酸盐、磷酸盐等。确定药物使用的溶媒配方后，在毒性试验中需增加对照组以保证溶媒本身无毒性作用，且其对供试品的动力学或药效学无明显影响[6]，如给药方式为静脉注射，需提前研究溶媒是否会引起溶血。

二、供试品分析方法验证

供试品的准确配制是保证试验成功的基础，因此配制后的供试品需经过分析。用于供试品分析的分析方法需提前经过验证，验证结束后需确定最终供试品的配制方法、配制后供试品的稳定性和保存条件、配制后供试品溶液性质（真溶液或混悬液）、供试品分析时需检测的项目、供试品分析的具体检测方法，因此供试品分析方法的验证主要包括供试品配制方法和测定方法2部分内容。

2.1 供试品配制部分方法验证

供试品配制方法部分验证需确定供试品的配制过程、供试品在溶媒中的稳定性、保存条件以及溶液是否均一[7]。若配制过程中涉及到加热、搅拌（除以溶解为目的外）等过程，验证时需确定具体参数，并考察耐用性，例如供试品需在热水中溶解，则验证中需确定热水的具体温度，且在该温度上下浮动一定范围内考察耐用性；供试品溶解后的稳定性数据和保存条件也应有验证试验得出，以保证供试品至少在配制到给药结束的时间段内稳定，且在该时间段内溶液的储存、转运方式不会影响供试品含量[8]；供试品经配置后是否为真溶液也应由方法验证得出结论，不能仅靠目测判断，可以通过测量供试品在溶媒中的溶解度或同一高浓度样品不同位置（取样位置可参照均一性检测）的浓度的相对标准偏差确定，例如，供试品在溶媒中的最大溶解度为1g/mL，则样品浓度低于最大溶解度时，溶液均为真溶液。

非临床研究中不同的试验可能选用不同的溶媒，分析人员可通过考察不同溶媒的基质效应确定由一种溶媒配制的标准品是否可以准确定量分析不同溶媒配制的样品，例如：试验中供试品需用水、氯化钠注射液和葡萄糖注射液溶解，则分析人员可通过使用水配制标准溶液，并用该标准溶液的结果分别标定3中溶媒配制的已知浓度的供试品溶液，若标定结果合格，则表明使用三种溶媒配制的供试品有相同的检测结果。稳定性和基质效应的验证均需覆盖试验的全部浓度范围，均一性验证浓度需不小于试验配制的最高浓度，三个项目均需对使用的溶媒分别验证，因此验证前专题负责人应提前告知分析人员试验时可能选用的溶媒和试验配制供试品浓度的大致范围，以便分析人员合理制定验证方案，避免重复性工作。

2.2 供试品分析部分方法验证

测定方法验证部分可参照《中国药典 第四部 9101 分析方法验证指导原则》[9]，除该指导原则外，还应结合使用的具体仪器确定运行前系统适用性的验证方法，表1列出了供试品分析中常用的3种仪器的指导原则和系统适用性验证内容。除仪器要求的系统适用验证内容外，实验中还应同时配制2份相同的标准品（或供试品）溶液，2者互相比较，用于确定样品称量和配制过程中的产生的误差在可接受范围内，系统适用性因在每次测定前考察，通过后方可进行下一步验证或检测，若系统适用性未通过，则之后的验证或检测结果应被认为不可靠，实验需重新进行。验证及供试品分析中可使用标准品或已知浓度的供试品定标。供试品分析属于含量测定，因此验证内容应包括：专属性、准确度、精密度、线性和耐用性。若分析方法不是委托方提供的含量检测方法，则专属性分析中除考察分离度外，还应提供峰纯度信息。为保证实验结果的可靠性，验证和分析中使用的仪器必须经过检定或验证，测定仪器应具有审计追踪系统，记录分析人员所作的每一步操作及原因；为避免人员主观性造成的误差，数据处理因由仪器自动积分，且同一序列需使用同一积分方法积分。

表1 不同仪器-系统适用性验证

三、供试品分析

验证全部项目结束后，非临床研究试验方可正式开始。需要进行配制的供试品溶液均需进行供试品分析，真溶液仅需检测含量，混悬液需检测含量和均一性。试验中首次配药，需做供试品分析，分析结果显示合格后，方可进行下一步实验，但无需在每次配药时均进行浓度分析，14天内的实验仅首次配药检测即可，长期给药试验（如30天），首末次配药检测；若时间大于3个月，除首末次外因试验中期因增加供试品分析次数；毒代和药代试验，采血当天应进行供试品分析[7]。若供试品检测中出现配制不合格的情况，则当天供试品需重新配制并检测，若之后的试验中仍需配制供试品，则接下来3次配制的供试品溶液也需经过检测，以确保供试品配制人员配制过程的准确性。

四、总结

供试品是保证获得药物非临床安全性评价可靠结果的基础，因此，选择合适的溶媒、确定合理的配制方法和开发准确的分析方法是非临床研究中需首先要解决的问题。

参考文献

[1] 《药物非临床研究质量管理规范》国家药品监督管理局, 第34号.

[2] 陈波、刘斌、岑小波. 特殊给药途径在非临床研究中的应用[C]//2018第八届药物毒理学年会—创新技术、评估风险、保障安全. 中国江苏南京.

[3] 《临床常用的给药途径有哪些》国家药品监督管理局.

[4] 吴纯启. 药物毒理学实验中供试品溶媒系统的选择与使用[C]//2010年全国药物毒理学学术会议论文集. 2010.08.12，中国青海西宁. 2010: 25.

[5] 《中国药典 第四部 药用辅料》[M]》，2020版. 2020: 561-843.

[6] 《药物单次给药毒性研究技术指导原则》国家药品监督管理局， 2014年，第4号通告.

[7] 《药物非临床安全性评价供试品检测要求的Q&A》国家药品监督管理局， 2014年，第4号通告.

[8] 孟祥，李莹，潘琦，等. 供试品检测在GLP研究中的意义及规范化要求[J]. 毒理学杂志（Journal of Toxicology），2011，25(06): 471-473.

[9] 李耀庭，梁金强，黄芝瑛. 药物安全性评价研究中供试品的检测与分析[J]. 药物评价研究（Drug Evaluation Research），2014，37(06): 541-543.

[10] 《中国药典 第四部 9101 分析方法验证指导原则》2020版. 2020: 480-483.

[11] 《中国药典 第四部 0512 高效液相色谱》2020版. 2020: 61-65.

[12]《中国药典 第四部 0521 气相色谱法》2020版. 2020: 67-68.

[13]《中国药典 第四部 0401 紫外-可见分光光度法》2020版. 2020: 39-843.

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